抗日战争爆发后，红十五军团奉命改编为国民革命军第八路军一一五师三四四旅，周世忠任该旅六八七团连指导员。参加了著名的平型关大战。此后，他先后担任营组织干事、副营长、营长，参加了晋察冀边区反击日军进攻、正太铁路破击战、反击日军对晋东南九路围攻、町店伏击战等战役和战斗。

1939年11月，周世忠因战功卓著，被上级调往八路军一一五师三四四旅六八九团任副团长。

1940年初，三四四旅经过整顿后，离开太行山南下支援新四军作战。周世忠奉命带一个营负责掩护全旅前进。一路上，他精心组织，及时把阻碍部队前进的敌碉堡打掉，遇有小股敌伪就将其击溃。部队过平汉铁路遭受到日军的炮击，驮东西的骡马被炮声惊散了，当行进到安全地带时，旅部派通讯员告诉周世忠，说驮电台的骡子不知去向。这时，敌人己从据点倾巢出动，前来追击。周世忠焦急万分，如果电台被敌人截获，不仅部队与延安失去联系，更重要的是我军所使用的电台频率及密码都会被敌人破获。情况十分危急，周世忠当机立断，让通讯员报告旅首长马上带领部队转移，自己则带着部分战士冒着生命的危险，按原路返回寻找丢失的骡子。最后，终于在铁路附近找到了丢失的骡子，并将其顺利地带回部队。由于周世忠勇敢灵活地采取行动，使部队迅速转移，脱离了与敌人的接触，从而避免了一场为争夺电台而与敌人发生的血战。

5月，周世忠接到上级命令，让他带一个加强营去鲁西南打击以石友三为首的顽军部队。临行前，旅长刘震对周世忠说：“现在部队中有很多人认为石友三人多势众，不好打，你是怎么看待这件事的呢？”

周世忠胸有成竹地回答：“接受任务后，我想了很多。我认为石友三虽说拥有3万兵力，但却是乌合之众。对付这种匪部的最好办法只有一个，那就是‘擒贼先擒王’，首先从石友三的指挥部开刀！”刘震满意地点了点头，表示赞成。

周世忠率部经过两天三夜的穿插来到离敌指挥部四、五华里的地方，先消灭了敌警卫团的一个营，尔后猛攻其指挥部。石友三被突如其来的攻击打得晕头转向，仓惶地率部逃跑。周世忠乘胜发起追击，将石友三匪部赶出百里之外，并沿途铲除了两个伪县政府，消灭杂牌军近千人。

当年秋天，为了进一步扩大和巩固抗日根据地，周世忠又奉命带一个营去怀远活动。当时怀远的红枪会有六、七千人，但这帮人不仅不抗日，还多次向抗日民主政府进行挑衅，甚至发展到捕杀和活埋抗日干部的严重事件。周世忠到怀远后，从团结抗日的大局出发，派人给当地最大的红枪会头子王海波送信，宣传我党我军的抗日主张，没想到王海波不但扣留送信人员，还率部前来攻打我军。周世忠在忍无可忍的情况下，迅速组织部队进行坚决反击，经过激战，击毙击伤红枪会匪徒200多人，匪首王海波亦被当场击毙。这次战斗的胜利对当地红枪会组织的震动很大，各红枪会的头目纷纷前来缴枪，有的表示愿意接受八路军、新四军的指导，从而扭转了该地区的抗日局面。

嗣后，周世忠又带这个营去半古店地区打游击。刚到那里，他便指挥部队打了个大胜仗，击溃顽军300多人，俘虏100余人，缴枪100多支。接二连三的胜利极大地鼓舞了部队的士气。然而在残酷斗争环境中，各种意想不到的情况随时都有可能发生。就在半古店地区打游击期间，一次惨痛的教训让周世忠感到铭心刻骨的痛苦。一天，部队接到情报，日军有一个骑兵连到半古店抢粮，周世忠和营里的几位领导商量后，经请示决定打一次伏击战，谁知这个情况不准确，交火后，周世忠感到日军兵力绝对不止一个连，而且随着战况的发展，日军越打越多。周世忠立即命令教导员带一个排和勤杂人员撤退，自己带领部分人员断后，然而，日军却凭借优势兵力冲上我方阵地。在兵力悬殊的情况下，周世忠带领掩护部队与日军展开白刃战，硬是坚持到教导员带领大部份人员安全撤退。这次战斗虽然毙、伤敌500多人，但我方亦伤亡惨重，部队基本打散，周世忠是被团长派来的收容队救回的。事后，周世忠得知，他们的对手不是一个连，而是一个骑兵师和一个步兵师。这次战斗的失利让他几天几夜睡不着觉，吃不下饭，很多同志都认为这次战斗并不是他一个人的责任，但他仍主动向上级提出要求，对自己进行记过处分，撤销自己副团长的职务。在以后的几十年中，他多次提起这个战例对个人的深刻教训，剖析自己，教育部属，表现了一个红军战士坦诚直率的性格和严于律己的精神。

1941年初，周世忠进入新四军第四师抗日军政大学四分校学习，任分校区队长。他自幼做童工、放牛娃，12岁当红军，从未踏过学堂门，但他在战斗间隙中、在工作实践中刻苦求取知识，终于也能识得几百个字。这是他第一次进入学校进行系统的学习。因此，十分珍惜这来之不易的机会，通过学习，他不但文化水平有了提高，而且政治理论水平也得到相应提高，为他以后工作中正确掌握政策和顺利完成党交给的工作任务奠定了基础。

1942年元旦，新四军四师抗大四分校组织篮球比赛。四师师长彭雪枫和十一旅旅长滕海清前去观看，篮球场上虎气生生的周世忠引起滕海清的注意。经彭雪枫介绍，滕海清将周世忠要到十一旅，任该旅三十二团副团长。周世忠到任后，奉命前往泗县、王河、灵壁一带开辟抗日根据地。

1943年10月，周世忠参加华东局党校学习和整风。尔后，他又先后担任十一旅兼第二军分区副参谋长、参谋长，淮北军区三分区参谋长等职，参加了卫东战役、淮北军民反“扫荡”作战、淮北军区部队春夏季攻势、宿南战役等，并指挥了打韩德勤独立旅，打尤集、邱集、时村等战斗。每次战斗前他都冒着生命危险到第一线了解敌情，有时还化装成老百姓到敌占区进行侦察，掌握第一手材料。由于战前准备工作做得好，因而他指挥的战斗都取得不俗的战绩，多次受到上级的表彰。